使用激光共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）拍攝合格的照片，需要遵循一系列步驟和技巧。以下是一些關(guān)鍵的步驟和注意事項(xiàng)：

一、樣品準(zhǔn)備

樣品固定與染色：

確保樣品經(jīng)過適當(dāng)?shù)墓潭ê腿旧?，以增?qiáng)對(duì)比度和熒光信號(hào)。

對(duì)于組織切片，控制切片的厚度以獲得Z佳的成像效果，通常待測(cè)樣品Z大厚度為1~2mm。

樣品封片：

蓋玻片厚度應(yīng)小于0.17mm，滑塊厚度為0.8~1.2mm。

固定或活的貼壁細(xì)胞應(yīng)當(dāng)培養(yǎng)在共聚焦專用培養(yǎng)皿或蓋玻片上；懸浮細(xì)胞甩片或滴片后，用蓋玻片封片，封片劑多采用甘油和PBS（pH 8.5~9）混合液（甘油:PBS=9:1）。

二、激光共聚焦顯微鏡設(shè)置

激光強(qiáng)度：

根據(jù)樣本的熒光特性調(diào)整激光強(qiáng)度，避免過度激發(fā)導(dǎo)致的光漂白。

激光強(qiáng)度的增強(qiáng)是用更高能量的激發(fā)光去激發(fā)熒光信號(hào)。

檢測(cè)器電壓：

檢測(cè)器光電倍增管可以把光子信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)并放大信號(hào)，具有極高的靈敏度和較低的噪音。

增加光電倍增管的電壓值可放大信號(hào)，提高成像亮度。但是檢測(cè)器的信號(hào)放大有一定限度，當(dāng)電壓值超過一定閾值檢測(cè)器噪音大幅度增加，會(huì)導(dǎo)致成像模糊。

圖片亮度和背景：

成像圖片的亮度和背景都是數(shù)字信號(hào)的改變，可以增加成像的對(duì)比度，但對(duì)成像分辨率沒有改變。

避免圖像過曝，過曝的成像片子存在熒光定量分析不準(zhǔn)的問題。

掃描速度和平均次數(shù)：

根據(jù)需要的圖像分辨率和采集速度選擇合適的掃描速度。較低的掃描速度可以提高圖像質(zhì)量，但會(huì)增加采集時(shí)間。

適當(dāng)增加平均次數(shù)（拍攝多張取平均值）可以提高信噪比，改善圖片的清晰度。

掃描分辨率：

采樣分辨率的大小直接決定是否能達(dá)到儀器的光學(xué)分辨率極限和Z終成像圖片的清晰度。

常規(guī)圖片采集推薦使用系統(tǒng)默認(rèn)的采樣分辨率，也可根據(jù)需求適當(dāng)調(diào)整。

三、拍攝技巧

選擇合適的物鏡：

為快速、準(zhǔn)確找到標(biāo)本、觀察和成像，一般采用由低到高變更物鏡（10倍→20倍→40倍/60倍）。

使用40倍物鏡時(shí)，需在鏡頭中央滴加適量蒸餾水；使用60倍物鏡時(shí)，需在鏡頭中央滴加適量共聚焦專用鏡油。

調(diào)節(jié)針孔參數(shù)：

薄標(biāo)本（如活細(xì)胞）需適當(dāng)增大針孔參數(shù)，從而有效保護(hù)標(biāo)本，提高亮度，得到反差更好的圖像。

厚標(biāo)本（如厚組織切片）則需適當(dāng)減小針孔參數(shù)，從而獲得更薄、更準(zhǔn)確、更精細(xì)的圖像。

使用自動(dòng)拼接功能：

當(dāng)樣品圖像的比例遠(yuǎn)超出顯微鏡的成像范圍時(shí)，可以使用自動(dòng)拼接功能生成高質(zhì)量的大尺寸照片。

四、其他注意事項(xiàng)

定期校準(zhǔn)：

定期校準(zhǔn)激光器和物鏡，確保激光的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性以及物鏡的清潔度，以獲得Z佳的成像質(zhì)量。

防光漂白：

使用抗光漂白劑，如DABCO或N-propyl gallate，以減少熒光信號(hào)的衰減。

軟件更新與維護(hù)：

保持軟件的Z新版本，以獲得Z佳的性能和功能。

按照制造商的指南進(jìn)行定期維護(hù)，包括清潔光學(xué)元件和更換消耗品。

生物安全與數(shù)據(jù)管理：

對(duì)于涉及生物樣本的實(shí)驗(yàn)，遵守相關(guān)的生物安全和倫理規(guī)定。

確保數(shù)據(jù)的管理和存儲(chǔ)符合科研誠信和隱私保護(hù)的要求。

遵循以上步驟和技巧，結(jié)合實(shí)踐中的不斷摸索和優(yōu)化，可以使用激光共聚焦顯微鏡拍攝出合格且高質(zhì)量的照片。